Homocysteine Assay kit

(enzymatic cycling)


사용 목적

Homocysteine Assay kit는 환자의 혈장 또는 혈청에서 total L-homocysteine을 정량 검출하는 체외진단용 시약이다.


분석 원리

Diazyme enzymatic tHcy assay 는 문헌에서 설명하는 것처럼 Hcy의 전환물질 또는 평가된 보조 기질 대신에 보조기질 전환물질을 평가하는 분석원리를 기초로 한다.

이 검사에서, 산화된 Hcy가 먼저 free Hcy로 환원되고 보조 기질과 반응한다. S-adenosylmethionine(SAM)은 Hcy S-methyltransferase 에 의해 methionine 형태와 SAH(S-adenosylhomocysteine)으로 촉진된다. SAH는 SAH hydrolase, adenosine deaminase 와 glutamate dehydrogenase를 포함하는 짝을 이룬 효소반응에 의해 평가된다. 거기서, SAH는 SAH hydrolase의해 adenosine과 Hcy로 가수분해된다. 보조기질 SAM으로부터 형성된 Hcy는 Hcy methyltransferase에 의해 Hcy 전환 반응으로 순환된다. 이것은 검출 신호을 증폭하는 효소 순환 반응 체계에 기초한 보조 기질 전환 물질을 형성한다. 형성된 Ado는 즉시 Inosine과 NAD+ 와 NADH로 전환하는 반응과 glutamate 가수분해효소와 반응하는 암모니아로 가수분해된다. 검체에서 Hcy 의 농도는 간접적으로 NADH의 양에서 NAD+로 전환되는 비율을 측정한다.(ΔA 340nm)


시약 조성

  성분                                                                    농도

S-adenosylmethionine(SAM)                          0.1mM

NADH                                                                  0.2mM

TCEP                                                                    0.5mM

2-oxoglutarate                                                     5.0mM

Glutamate dehydrogenase                               10KU/L

SAH hydrolase                                                 3.0KU/L

Adenosine deaminase                                     5.0KU/L

Hcy methyltransferase                                    5.0KU/L


시약 구성


    R1                R2                R3               Calibrator                           

주의사항

1. 체외진단용으로만 사용한다.

2. human sourced materials 인 검체와 시약은 잠재적인 감염의 위험이 있으므로,

   검사실 안전규정을 따르시오.

3. 검사를 진행하고 난 후, 결과는 환자의 임상적 상태와 모든 다른 검사 결과를 참조하여

   설명하여야한다.

4. 시약을 삼키거나, 피부에 닿거나, 점막에 닿지 않도록 주의한다.

5. 다른 lot no.의 시약과 바꾸어 사용해서는 안 된다.


시약 사용법

  공급한 그대로 사용한다. 사용후 즉시 vial을 닫으시오.


유효기간 및 저장

Hcy Assay 시약은 2-8℃에서 보관할 때, package label 이 가리키는 기간까지 유효하다.

Open한 시약은 2-8℃에서 보관할 때, 12주간 유효하다.


검체 채취 및 조작법

신선한 serum 과 헤파린 혈장은 Hcy 검사의 적절한 검체이다. EDTA 혈장은 적절한 검체가 아니다. 용혈 되었거나, 혼탁한 검체, 심각한 lipemic 검체는 적절한 검체가 아니다.

세포로부터 혈장을 분리한 후 Hcy는 실온에서 4일간 안정하고, 0 - 2℃에서 수주간 안정하고, -20℃에서 수개월 또는 수년간 안정하다. 검체에 대한 전처리과정이 없다.

Assay Procedure


  R1A/R1B : 240㎕             R2 : 25㎕

  Sample : 15㎕    

                                                  ↓                                                        37℃

0               340nm        5               7.5        10min

                                                A1        A2

정도 관리

각 검사실은 Hcy 검사를 위하여 Hcy control을 사용한다. Hcy의 정상과 비정상 범위를 갖는 control은 회사로부터 공급받을 수 있다. 적절한 범위는 각각의 검사실에서 세워야한다.


주의 사항

* 시약은 깨끗해야 한다. 만일 시약이 혼탁하거나, 초기 흡광도가 0.5(340nm)보다 적다면

  시약을 사용하지 마시오.

* 적혈구에서 Hcy 생성을 방해하는 3-deazaadenosine 의 첨가는 권장한다.

  그러나,Diazyme Hcy 검사는 3-deazaadenosine 이 검사에서 key 효소중의 하나를

  억제하기 때문에, 3-deazaadenosine을 가진 검체를 사용하지 않는다.

기댓값

12-19세

60세 이상

‘고치’에 대한 Cut-Off

(μ㏖/L)

              4.3 - 9.9

3.3 - 7.2

                         5.9 - 15.3

   4.7 - 11.6

                      11.4 이상

10.4 이상

 

대부분의 문헌에서 15 μ㏖/L이 정상범위의 Cut -Off로 사용된다. 각 검사실은

그 지역 집단에 대한 정상 범위를 세우기를 추천한다.

 

시약의 특성

정확성

상관 관계 는 66 serum과 plasma 로 현재 사용되고 있는 시약과 비교하였다.

r ²=0.976  기울기 0.98  intercept = 0.87

정밀성

정밀성은 NCCLS EP-5 protocol 에 따라 Diazyme 효소 Hcy 시약을 이용하여 관리하였다.

Within-run test 와 between-run test는 20일 동안 두 개의 level control에 의해 test하였고,

각 level 당 4번 씩 진행하였다.


 

Within-run

Level 1

(7μM Hcy)

Level 2

(12μM Hcy)

Level 3

(29.5μM Hcy)

No. of Points

40*

80

80

 Mean(μM)

 7.2

 13.2

 29.1

 SD(μM)

 0.156

 0.639

 0.811

 CV%

 2.2%

 3.0%

 1.8%

 

Total precision

 Level 1

(7μM Hcy)

Level 2

(12μM Hcy)

Level 3

(29.5μM Hcy)

 No. of Points

 40*

 80

 80

 Mean(μM)

 7.2

13.2

 29.1

 SD(μM)

 0.285

0.72

0.92

 CV%

 4.1%

 5.9%

 4.0%

 

 


 

민감도

Diazyme Homocysteine Enzymatic Assay 의 검출 한계는 평균값 + 3SD로서 정한다.


직선성

이 검사는 5에서 50μM homocysteine의 범위를 측정한다.